molrepでお手軽分子置換

030918 S. Fushinobu
060329 修正

PDBの構造登録数はうなぎ登りの昨今、分子置換でどんどん構造を解いていきましょう！

Michael G. Rossmann先生に敬意を払いつつ^*・・・

注１：ccp4iのインストールは必須です。バージョンはできるだけ新しいものを。
注２：molrepはAlexei Vaginの作っているプログラムです。ccp4にはデフォルトで入っていますが、彼のHPには最新版があります。
注３：ccp4 6.0の公開にともない、molrepもバージョンが上がり、さらに使いやすくなりました。

1. モデル分子の選択
2. アシメの分子数
3. 反射ファイルの変換
4. molrep
5. 複数のドメインからなる場合
6. ホモロジーの低い分子でモデリングする場合

1. モデル分子の選択

• 自分のタンパク質のアミノ酸配列と相同性の高い配列をPDBから検索する。
  • NCBIのblastpでdatabaseをpdbにして検索する。
  • 最近はPDBでもblastをかけられるので、こっちの方がよい。
• PDB IDが分かったら、それをPDBからゲットする。
• 相同性が高い（40〜50%以上？）場合には、ホモロジーモデリングしたPDBファイルを使うと、後で精密化の時に側鎖を変異させる手間が省ける。
  • 3D-JIGSAWを使う場合（こっちの方が挿入／欠失に強いのでオススメ）
    • アミノ酸配列と自分のメールアドレスをsubmitすれば、しばらくしたら返事が返ってくる。
    • そのままだと温度因子（右端の数字）が0.0のままなので、テキストエディタの変換機能等を使って適当な数に変換しておく（ex. 20.0）
  • SWISS-MODELを使う場合
    • First Approach modeでアミノ酸配列と自分のメールアドレスを入れればしばらくしたら返事が返ってくる。
    • Results optionsは、Short modeかNormal modeがおすすめ。
    • SWISS-MODELは、アミノ酸の挿入／欠失には弱いので、最も相同性の高いアミノ酸配列とClustalWなどを使ってアラインメントした結果を参考に、適当に挿入／欠失させた配列を送るのがよい。
  • 最近3D-JIGSAWの調子が悪いみたいなので、CPHmodelsなど使ってみるのもアリ。
  • CCP4の中に入っているChainsawも使ってみてはどうでしょう。計算があまりに早くて頼りないんですが、ベストの結果が出たこともありました。Molecular Replacement -> Model Generation -> Create search modelで使えます。アラインメント（入力）ファイルは、色んなフォーマットに対応しているようです。例えば、BLASTの結果を直接コピペしたものも使えます。
  • PDB上の相同構造の候補が多く、コンフォメーションが複数あったりする場合には、Molrepを使うよりもBALBESやMrBUMP（三沢？）で複数の候補を網羅的にサーチした方がよいでしょう。
• 相同性が低い場合にはこちらを参照。
• ただし、molrepを走らせるときに自分の蛋白質のアミノ酸配列を入れておけば、側鎖を適当にモデリングしたものを作ってくれるようです（どのていど使えるのかは未確認）。

2. アシメの分子数

• Mathews Probability Calculator @ BR's BR's Macromolecular Crystallography Website またはVm calculatorで計算しておく。Vmの範囲を参考に、アシメの分子数を見積もる。
• 溶媒含量で通常は40〜70%台の範囲。ただし、20%台や80%台のタンパク質結晶も存在するので、要注意(Kantardjieff, K. A. and Rupp, B. Protein Sci. 12, 1865-1871, 2003)。
• ccp4iのMolecular Replacement→Cell Content Analysisでも計算できるので念のためやっておくこと。

3. 反射ファイルの変換

• ccp4iでIからFに変換しちゃいましょう。
• mtz形式のファイル(ex. KEK-PFのDPS/mosflm/scala)なら、Data Reduction→Convert Intensities to SFsで。
• HKL2000(Scalepack)や、d*trek(R-axis; Rigaku MSCのCrystalClearなど)のファイルなら、Data Reduction→Import Scaled Dataで。一番上のタブから変換元のフォーマットを選ぶ。
  • 通常はUse anomalous dataはoff、Free R flagは0.05 (5%)。
  • dataset nameを入れるのを忘れないこと
  • 予想されるアシメの残基数を入れる。
  • 消滅則のある軸のデータが取れてなくて、らせん軸などが分かっていない場合は、空間群はとりあえずLaue Classの一番上を入れておく。 [空間群の表]
• 後でCNSを使って精密化する場合は、Reflection Data Unitilites→Convert from MTZでCNSフォーマットに反射のmtzファイルを変換しておく。使うカラムは通常はFP, Sigma, FreeRだけで十分。

4. molrep

• （ccp4i ver. 6.0.0用に改訂しました）
• Molecular Replacement→Molrep-auto MRを選択
• アシメに２分子以上と見積もられる場合には、self rotation functionを試してみるとNCSが分かる場合がある。（Doのタブからself rotation functionを選ぶ）Integration Radiusは分子（１個）の半径と直径の間の値を入れる。デフォルトは30Å。
  • psファイルをdisplayコマンド等を使って見る。例えば、NCSの２回軸がある場合は、Chi=180度のマップに、Crystallographic Symmetry以外の場所に強いピークが見えるはず。ちなみに、この図は極座標(polar angle; Phi, Psi)のマップを「北極」から見ている。
• 通常の分子置換は、Do "molecular replacement" performing "rotation and translation function". Get input structure factors from "MTZ file". でやるのが普通でしょう。
• Use sequenceをチェックしてSeq inにpirファイル（１行目：>の後にseq名、２行目は空、３行目から配列, 参考）を入れるとモデルを修正して使ってくれる。これは利用したほうがよい。ログファイルに、sequence alignmentの結果や、identityも出てくるのでメモしておこう。
• MTZ in, MODEL in を入力。FPとSIGFPのカラムが入力したdataset nameと一致してるか確認。Seq inは入力しなくてもよい。
  • PDBファイルの中の水分子や余計なヘッダーは、エディターなどを使って取っておくのが無難。オリゴマーがPDBファイルに入っている場合には、もちろんモノマーにしておく。（サブユニット間の並びがモデルと同一であるかも知れないので、オリゴマーのままでmolrepをかける手もありますが、まずはモノマーで試すのがおすすめ）
  • ヘムなどのでっかいリガンドは、入っていることを確信するならば入れたままでもよい。
  • Rasmolなどで表示して見て、一応確認しておく。
• The Modelパネル
  • Apply .... Modelのタブは、通常は、"set Bvalues related to accesibility & shift origin"だが、ポリアラニンモデルを使いたければ、"convert to polyalanine & shift origin"にする。
  • Expect .... fraction completeness of model with .... fraction similarity to input structure は、別に入れなくても良いが、分かっているなら入れておいてもバチは当たらない。
• Search Parametersパネル
  • アシメに複数分子ある場合には、Search for ... monomers in the asymmetric unit に数を入れると２分子目以降を探しに行く。
  • Self Rotationの解がはっきり分かっている場合はLocked Rotation Functionを使うこともできる。（ノイズを減らすのに有効とされていますが、私はまだ試したことありません）
  • Search for .. peaks ...に数字を入れる。相同性が低い場合には、rotation、translation双方で20づつは探した方がよい。Rotationの下位に正解が出ることは結構ある。逆に、translationの下位に出ることは少ない。
  • Pseudo-translation vectorはデフォルトのautoにしておくとチェックしてくれる。これまでpseudo-translationが出てきたことはないですが。
  • Output the closest of .... のチェックは入れておいた方が良い。
• Infrequently Used Parametersパネルの中の、最初のChange space groupのタブで、Laue Class中の任意の空間群で計算することができる。全く分からない場合には、Check allにする。消滅則などである程度絞り込まれている場合にはdefine space groupを選べば時間を節約できる。
• R-factorとCorrelationが「他の解に比べて有意に高い」のが正解。モデル分子との相同性にもよるが、50%台前半のR-factor になることが多い。同じタンパク質がモデルならば、40%台程度の解が出るのが普通。
• 複数分子を探す場合には、２分子目、３分子目とR-factorが「格段に」良くなっていくことを確認する。余裕があれば、正解の数+1分子目を探しに行かせて、結果がコケるのを確認しておくこと。
  • 全ての分子が見つけきれていないと感じる場合には、Input fixed modelを使う。
• あとは、CNSなどを使っての精密化へGO!
  • 追記：いきなりRefmac5に行ってrigid body→restrained refinementをかけるのがオススメです。ccp4 6.0.0以降は特に簡単になってます。
• 分解能2.3Å以上の反射が得られていて、次にARP/wARPを使う時に、アシメに２分子入っている場合には、molrepの出力したPDBファイルの中の、A/B chainsの間に数行入っていて（モノマーだと勘違いされるために）うまくいかない場合があるので、これを除くべし。よく分からない場合には、まずRefmacをかけて、その出力のmtz fileに入っているFcとFOMを使う。

5. 複数のドメインに別れている場合

• モデル分子（＝目的の分子）が複数の「動きやすい」ドメインに別れている場合
• とりあえずPDBファイルをエディター等をつかって分ける。
• まずは大きいドメインだけで探しに行く。同程度のサイズならば両方やってみる。
• もう一つのドメインを探しに行くには、molrepのInput fixed modelのチェックをONにして、現れてくるFixed in にその前のoutput PDBを入れる。
  • ２つめのドメインを探しに行った結果が芳しくない場合には、１つめのドメインだけを使った解を使って精密化に進みましょう。手でモデルを構築するのは大変ですが、分解能が高い場合にはArp/wArpの助けを借りましょう。

5. ホモロジーの低い分子でモデリングする場合

• ホモロジーの低い分子(20-30% Seq. Identity)でモデリングする場合にも使えるサーバー。
• 3D-PSSM
• FUGUE Profile Lib Search
• HMMSR/ROSETTA
  • Special thanx to: rjmorris@ebi (Richard), Eleanor Dodson, and ccp4bb